Muzeum zajmuje część obiektów w XVIII-wiecznym zespole pałacowym Radziwiłłów, działy archeologii, etnografii, artystyczny. Posiada największą w Polsce kolekcję ikon, ok. 1600 (ciekawostka – niemal wszystkie obrazy gromadzone od 1980 r. pochodzą z udaremnionego przemytu na nadbużańskich przejściach granicznych), najcenniejsze z połowy XVII w. Dumą muzeum są też kolekcje malarstwa koni (plon plenerów w stadninie w Janowie Podlaskim) i zbiór prac ludowego malarza Bazylego Albiczuka, „Nikifora Podlasia”. Prócz tego dział etnograficzny z bogatymi zbiorami kultury materialnej Południowego Podlasia i kolekcja numizmatyczna.
Stałe ekspozycje dostępne dla zwiedzających Muzeum Południowego Podlasia:
- Ikona święta tajemnica,
- Konie, jeźdźcy, zaprzęgi w malarstwie polskim XIX i XX wieku,
- Biała Podlaska. Obrazy z historii miasta